Nuclear Receptors, Volume 364 (Methods in Enzymology) pdf epub mobi txt 电子书 下载 2026

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出版者:Academic Press

作者:Russell, David W. 编

出品人:

页数:545

译者:

出版时间:2003-11-24

价格:USD 175.00

装帧:Hardcover

isbn号码:9780121822675

丛书系列:

图书标签:

• Nuclear Receptors
• Methods in Enzymology
• Endocrinology
• Molecular Biology
• Signal Transduction
• Receptor Biology
• Gene Regulation
• Biochemistry
• Pharmacology
• Steroid Hormones

好的，这是一本关于核受体研究的综合性指南的详细介绍，侧重于实验技术和方法学，但不包含您提到的特定卷册《Nuclear Receptors, Volume 364 (Methods in Enzymology)》的内容。 --- 生物化学与分子生物学前沿：核受体研究的实验方法学进阶 导言：理解核受体的调控复杂性 核受体超家族是细胞信号传导、基因表达调控以及生物体内稳态维持的关键分子集合。它们横跨类固醇激素受体、甲状腺激素受体、维生素D受体以及PPARs（过氧化物酶体增殖物激活受体）等多个功能类别，通过直接与靶基因DNA序列结合，调控着从发育、代谢到免疫应答等几乎所有生命过程。 对核受体的深入研究，要求研究人员掌握一系列精细、高灵敏度且具有高度特异性的技术。本指南旨在提供一个全面且深入的实验方法学视角，涵盖了从核受体蛋白的提取、纯化，到其DNA结合活性、蛋白质相互作用网络的解析，以及最终在细胞和动物模型中功能验证的完整流程。重点关注那些能够揭示核受体在生理和病理状态下动态行为的先进技术。 第一部分：核受体蛋白的获取、鉴定与结构分析 1. 核受体蛋白的表达、纯化与质量控制 核受体的研究始于获得高质量的重组蛋白。本部分详述了针对不同亚型核受体（如配体结合域 LBD、DNA 结合域 DBD 或全长蛋白）的表达策略。 原核与真核表达系统的选择： 探讨了使用大肠杆菌（E. coli）原核系统进行高产量表达的优势与挑战，尤其是在处理需要翻译后修饰或复杂折叠的核受体亚基时。同时，详细介绍了在哺乳动物细胞（如 HEK293T 或 Sf9 昆虫细胞）中使用杆状病毒系统表达内源性或修饰核受体蛋白的方法，以确保功能的正确性。 亲和层析与高分辨率纯化： 阐述了利用标签技术（如 GST、His-tag、GST-标签）进行初步纯化后的进一步精细分离步骤。重点介绍基于离子交换层析和分子筛层析的组合方案，以达到用于结构生物学研究所需的极高纯度。 蛋白质活性与构象鉴定： 讨论了如何通过 Circular Dichroism (CD) 验证蛋白质二级结构，以及使用表面等离子体共振（SPR）或动态光散射（DLS）评估蛋白的稳定性和寡聚状态。 2. 结构生物学方法：解析配体结合口袋 理解核受体如何感知配体并触发构象变化，是调控其活性的核心。 X射线晶体学在核受体中的应用： 提供了高分辨率结构解析的详细方案，包括蛋白质结晶的优化条件（pH、盐浓度、沉淀剂筛选）以及如何成功解析含有配体或共激活因子/抑制因子复合物的结构。强调了结构域之间的柔性对结晶过程的影响及应对策略。 冷冻电子显微镜（Cryo-EM）的兴起： 针对核受体复合物（例如与 DNA 结合的四聚体或泛素化复合物）的动态性和异质性，本指南详细介绍了 Cryo-EM 在解析宏大分子机器结构中的应用，包括样品制备、数据采集和图像重建的关键参数设置。 第二部分：体外与细胞内功能活性测定技术 3. 配体结合与激活测定 测定配体与核受体的亲和力及其诱导的构象变化，是药物筛选的基础。 竞争性结合试验： 阐述了如何利用放射性标记或荧光标记配体进行高通量竞争性结合分析，以精确计算 $K_i$ 值。 基于构象变化的生物物理方法： 详细介绍了使用时间分辨荧光（TR-FRET）或傅里叶变换红外光谱（FTIR）来实时监测配体结合后 LBD 区域的构象变化的实验方案，这对于区分激动剂、拮抗剂和部分激动剂至关重要。 4. 转录激活能力的评估：从体外到细胞模型 核受体功能的核心在于其转录调控能力。 报告基因系统（Luciferase/GFP Assays）： 详述了构建功能性报告基因载体的设计原则，包括选择合适的 DNA 反应元件（HREs/PBEs）和启动子。介绍了如何优化转染效率、标准化实验数据以进行跨板比较，以及如何通过双报告基因系统校正细胞毒性。 ChIP 实验的优化： 染色质免疫沉淀（ChIP）是确定核受体体内结合位点的“金标准”。本节深入探讨了抗体选择（特别关注区分激活态和非激活态的抗体）、交联条件的优化（甲醛浓度与时间）、以及从免疫沉淀产物中富集特定 DNA 片段后进行定量 PCR (qPCR) 或高通量测序 (ChIP-seq) 的详细步骤。 第三部分：核受体相互作用组的解析 核受体的功能很少是孤立的，它们依赖于复杂的蛋白质-蛋白质相互作用网络（PPIs）。 5. 共激活因子与共抑制因子的筛选与验证 酵母双杂交（Y2H）的高级应用： 介绍了如何使用改进的 Y2H 系统筛选新的核受体相互作用伴侣，并讨论了如何通过特定突变体来消除自激活问题。 蛋白质相互作用组的捕获： 详述了免疫共沉淀（Co-IP）的精细操作，包括使用低离子强度缓冲液和去交联步骤以捕获瞬态或弱结合的复合物。对于更精细的分析，介绍了亲和纯化-质谱联用技术 (AP-MS)，用于鉴定与特定核受体亚型（例如，在特定药物刺激下）结合的整个蛋白质组。 6. 核受体信号网络的动态成像 为了观察核受体在活细胞内的时空动态，先进的成像技术必不可少。 FRET/BRET 技术的应用： 阐述了如何利用荧光共振能量转移（FRET）或生物发光共振能量转移（BRET）来实时监测核受体二聚化、与共调节因子结合或核易位的过程。重点讨论了如何设计合适的 FRET/BRET 供体-受体对，以保证信号强度和特异性。 活细胞成像与漂白后荧光恢复 (FRAP)： 介绍了使用核受体-荧光蛋白融合体在活细胞内追踪其核质穿梭的动力学过程。FRAP 实验被详细描述为量化核受体在染色质结合与游离池之间的交换速率的有效工具。 第四部分：体内模型中的功能验证与成像 7. 转基因与条件性敲除小鼠模型的建立与分析 将体外发现转化为整体生物学意义，需要可靠的动物模型。 Cre-LoxP 系统的精确控制： 详细讨论了如何利用特定组织或时间点特异性的 Cre 酶（如 Adipoq-Cre 或 Albumin-Cre）来建立条件性敲除（cKO）核受体的小鼠模型，以研究其在肝脏、脂肪组织或内分泌腺中的生理功能。 代谢表型分析： 针对代谢性核受体（如 PPARs 或 LXRs），本指南提供了全面的体内表型分析方案，包括高脂饮食诱导的胰岛素抵抗模型、脂肪酸氧化速率测定、以及肝脏脂肪变性的组织学和生化评估。 8. 核受体与组织微环境的相互作用 组织特异性蛋白质组学： 介绍了利用前沿的定量蛋白质组学技术，如 TMT 标记和高分辨率质谱，来比较野生型与核受体突变小鼠特定组织（如肾上腺或脑部）的蛋白表达谱变化，从而发现新的下游信号通路或调控靶点。 本指南提供了一套全面且不断更新的实验工具箱，旨在赋能研究人员克服核受体研究中的技术瓶颈，揭示这些核心调控因子在复杂生命现象中的精确机制。

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我购买这本书的初衷是希望能在表观遗传学与核受体调控的交叉领域找到突破口，特别是在组蛋白修饰酶与受体复合物结合模式的解析技术方面。因此，我花了相当大的篇幅去研读其中关于染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）优化方案的部分。书中详细对比了不同交联试剂对核受体特异性结合位点捕获效率的影响，这确实提供了宝贵的优化思路。然而，我在寻找如何结合Proximity Ligation Assay (PLA) 或 Hi-C技术来研究核受体在三维基因组结构中发挥作用的具体操作流程时，发现这部分内容相对简略，更像是对现有技术的简单罗列，而非深入的实操指导。我期待看到的是如何设计特异性的引物对，如何有效去除背景噪音，以及如何处理PLA产生的大量图像数据以量化受体在核内特定“热点”区域的聚集程度。目前的描述更像是前置知识的介绍，而不是前沿技术的深度应用指南，这让我感到在最想攻克的难题上，这本书的“方法论”深度略有不足。

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这本书的封面设计着实引人注目，那种深邃的蓝色调配上精密的科学插图，一下子就抓住了我的眼球。我当时正在寻找一些关于基因调控和信号通路的前沿研究方法，手头上的资料大多陈旧或者过于理论化，缺乏实操指导。这本书的厚度和专业性让我对它抱有极高的期望，尤其是它隶属于“Methods in Enzymology”这个久负盛名的系列，这意味着内容必然是经过严格筛选和验证的“干货”。我翻阅了目录，发现其中关于核受体激动剂筛选和下游信号分子鉴定的章节，那种详尽的步骤描述，简直就像是直接从实验室的SOP（标准操作程序）中摘录出来的一样。这对于我们这种需要快速建立和优化实验流程的课题组来说，简直是雪中送炭。我特别留意了其中关于高通量筛选技术的部分，作者似乎并未停留在理论层面，而是深入探讨了如何克服传统酶联免疫吸附试验（ELISA）在定量分析核受体活性时的局限性，转而推荐使用基于BRET/TERA等新型报告基因系统的实时监测方法。这种注重实用性、紧跟技术革新的态度，让我对后续的学习充满信心，相信它能迅速提升我实验的准确性和效率。

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这本书给我的整体感受是，它是一份极其扎实、信息密度极高的“工具箱”，而不是一本连贯的“读物”。它的价值在于它所收录的那些经验性、细节化的技术参数和“民间智慧”，这些是大型综述文献无法提供的。比如，书中关于如何使用特定抗体处理细胞核提取物以防止核受体磷酸化失活的“小窍门”，对于日常实验的成功率有着立竿见影的提升作用。不同作者撰写的章节之间，风格差异较大，有的极其详尽，如对质谱联用技术在核受体相互作用组研究中的应用描述，几乎可以作为一篇独立的综述来引用；而另一些章节则显得有些仓促，对一些新兴的成像技术（如STORM/PALM在核内受体成像中的应用）的介绍过于泛泛。总而言之，如果将这本书看作一本参考手册，它无疑是顶级的，但如果期待它能像一本结构完整的科学专著那样，提供一个从宏观到微观、逻辑严密的知识体系，那么它在某些前沿章节的深度和广度上，还有提升的空间，适合已经有一定基础，急需解决特定技术瓶颈的研究人员使用。

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这本书的装帧和排版风格继承了该系列一贯的严谨和实用主义路线，文字密度极高，几乎没有多余的空洞描述，直奔主题。这对于我这种习惯了快速提取关键信息的研究人员来说，是一种效率的体现。尤其值得称赞的是，书中对各种缓冲液配方和试剂浓度的标注异常精确，甚至细化到了特定批次试剂的适用性建议，这在很多通用教科书中是看不到的细节。我在尝试复现其中一个关于视黄酸受体（RAR）转录激活活性的体外重建实验时，严格按照书中的“Protocol 4.2”进行操作，结果得到了比以往任何一次都稳定和可重复的结果。这强烈的可重复性印证了其作为“方法学”专著的权威性。不过，这种极端的实用性也带来了一个小小的副作用：图表的视觉化效果相对欠缺，很多关键的数据趋势需要读者花费额外精力去对比文本描述才能完全理解，如果能在关键的机制图示上采用更多彩色、高清的分子模型渲染，而不是传统的黑白线条示意图，对于理解复杂的蛋白质-蛋白质相互作用网络会更有帮助。

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坦白说，我购买这本书时，内心是抱着一种近乎“朝圣”的心态去期待的，毕竟这是一个专门聚焦于“核受体”这一复杂调控家族的深度挖掘。然而，初读几章后，我发现它在基础理论的铺陈上略显保守，仿佛是为已经非常熟悉该领域背景的专家准备的“高级参考手册”，而非一本能够带领初学者入门的教材。例如，在阐述经典的配体结合域（LBD）与DNA结合域（DBD）的互作机制时，引用的文献大多集中在十年前的经典发现上，对于近五年内涌现出的全新转录因子协同作用模型探讨得不够深入。我更期望看到一些关于新型核受体亚型（比如一些孤儿受体）在代谢疾病中最新被发现的功能数据，以及如何利用CRISPR/Cas9等基因编辑工具来精确模拟体内环境，以更好地研究这些受体在生理和病理状态下的动态变化。如果能在方法论之外，增加一到两个具有突破性的案例研究，展示如何利用书中的技术成功解析一个未知的信号级联反应，那这本书的价值无疑会更上一层楼。

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