Nuclear Receptors, Volume 364 (Methods in Enzymology) pdf epub mobi txt 電子書 下載2026

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出版者:Academic Press

作者:Russell, David W. 編

出品人:

頁數:545

译者:

出版時間:2003-11-24

價格:USD 175.00

裝幀:Hardcover

isbn號碼:9780121822675

叢書系列:

圖書標籤:

• Nuclear Receptors
• Methods in Enzymology
• Endocrinology
• Molecular Biology
• Signal Transduction
• Receptor Biology
• Gene Regulation
• Biochemistry
• Pharmacology
• Steroid Hormones

好的，這是一本關於核受體研究的綜閤性指南的詳細介紹，側重於實驗技術和方法學，但不包含您提到的特定捲冊《Nuclear Receptors, Volume 364 (Methods in Enzymology)》的內容。 --- 生物化學與分子生物學前沿：核受體研究的實驗方法學進階 導言：理解核受體的調控復雜性 核受體超傢族是細胞信號傳導、基因錶達調控以及生物體內穩態維持的關鍵分子集閤。它們橫跨類固醇激素受體、甲狀腺激素受體、維生素D受體以及PPARs（過氧化物酶體增殖物激活受體）等多個功能類彆，通過直接與靶基因DNA序列結閤，調控著從發育、代謝到免疫應答等幾乎所有生命過程。 對核受體的深入研究，要求研究人員掌握一係列精細、高靈敏度且具有高度特異性的技術。本指南旨在提供一個全麵且深入的實驗方法學視角，涵蓋瞭從核受體蛋白的提取、純化，到其DNA結閤活性、蛋白質相互作用網絡的解析，以及最終在細胞和動物模型中功能驗證的完整流程。重點關注那些能夠揭示核受體在生理和病理狀態下動態行為的先進技術。 第一部分：核受體蛋白的獲取、鑒定與結構分析 1. 核受體蛋白的錶達、純化與質量控製 核受體的研究始於獲得高質量的重組蛋白。本部分詳述瞭針對不同亞型核受體（如配體結閤域 LBD、DNA 結閤域 DBD 或全長蛋白）的錶達策略。 原核與真核錶達係統的選擇： 探討瞭使用大腸杆菌（E. coli）原核係統進行高産量錶達的優勢與挑戰，尤其是在處理需要翻譯後修飾或復雜摺疊的核受體亞基時。同時，詳細介紹瞭在哺乳動物細胞（如 HEK293T 或 Sf9 昆蟲細胞）中使用杆狀病毒係統錶達內源性或修飾核受體蛋白的方法，以確保功能的正確性。 親和層析與高分辨率純化： 闡述瞭利用標簽技術（如 GST、His-tag、GST-標簽）進行初步純化後的進一步精細分離步驟。重點介紹基於離子交換層析和分子篩層析的組閤方案，以達到用於結構生物學研究所需的極高純度。 蛋白質活性與構象鑒定： 討論瞭如何通過 Circular Dichroism (CD) 驗證蛋白質二級結構，以及使用錶麵等離子體共振（SPR）或動態光散射（DLS）評估蛋白的穩定性和寡聚狀態。 2. 結構生物學方法：解析配體結閤口袋 理解核受體如何感知配體並觸發構象變化，是調控其活性的核心。 X射綫晶體學在核受體中的應用： 提供瞭高分辨率結構解析的詳細方案，包括蛋白質結晶的優化條件（pH、鹽濃度、沉澱劑篩選）以及如何成功解析含有配體或共激活因子/抑製因子復閤物的結構。強調瞭結構域之間的柔性對結晶過程的影響及應對策略。 冷凍電子顯微鏡（Cryo-EM）的興起： 針對核受體復閤物（例如與 DNA 結閤的四聚體或泛素化復閤物）的動態性和異質性，本指南詳細介紹瞭 Cryo-EM 在解析宏大分子機器結構中的應用，包括樣品製備、數據采集和圖像重建的關鍵參數設置。 第二部分：體外與細胞內功能活性測定技術 3. 配體結閤與激活測定 測定配體與核受體的親和力及其誘導的構象變化，是藥物篩選的基礎。 競爭性結閤試驗： 闡述瞭如何利用放射性標記或熒光標記配體進行高通量競爭性結閤分析，以精確計算 $K_i$ 值。 基於構象變化的生物物理方法： 詳細介紹瞭使用時間分辨熒光（TR-FRET）或傅裏葉變換紅外光譜（FTIR）來實時監測配體結閤後 LBD 區域的構象變化的實驗方案，這對於區分激動劑、拮抗劑和部分激動劑至關重要。 4. 轉錄激活能力的評估：從體外到細胞模型 核受體功能的核心在於其轉錄調控能力。 報告基因係統（Luciferase/GFP Assays）： 詳述瞭構建功能性報告基因載體的設計原則，包括選擇閤適的 DNA 反應元件（HREs/PBEs）和啓動子。介紹瞭如何優化轉染效率、標準化實驗數據以進行跨闆比較，以及如何通過雙報告基因係統校正細胞毒性。 ChIP 實驗的優化： 染色質免疫沉澱（ChIP）是確定核受體體內結閤位點的“金標準”。本節深入探討瞭抗體選擇（特彆關注區分激活態和非激活態的抗體）、交聯條件的優化（甲醛濃度與時間）、以及從免疫沉澱産物中富集特定 DNA 片段後進行定量 PCR (qPCR) 或高通量測序 (ChIP-seq) 的詳細步驟。 第三部分：核受體相互作用組的解析 核受體的功能很少是孤立的，它們依賴於復雜的蛋白質-蛋白質相互作用網絡（PPIs）。 5. 共激活因子與共抑製因子的篩選與驗證 酵母雙雜交（Y2H）的高級應用： 介紹瞭如何使用改進的 Y2H 係統篩選新的核受體相互作用伴侶，並討論瞭如何通過特定突變體來消除自激活問題。 蛋白質相互作用組的捕獲： 詳述瞭免疫共沉澱（Co-IP）的精細操作，包括使用低離子強度緩衝液和去交聯步驟以捕獲瞬態或弱結閤的復閤物。對於更精細的分析，介紹瞭親和純化-質譜聯用技術 (AP-MS)，用於鑒定與特定核受體亞型（例如，在特定藥物刺激下）結閤的整個蛋白質組。 6. 核受體信號網絡的動態成像 為瞭觀察核受體在活細胞內的時空動態，先進的成像技術必不可少。 FRET/BRET 技術的應用： 闡述瞭如何利用熒光共振能量轉移（FRET）或生物發光共振能量轉移（BRET）來實時監測核受體二聚化、與共調節因子結閤或核易位的過程。重點討論瞭如何設計閤適的 FRET/BRET 供體-受體對，以保證信號強度和特異性。 活細胞成像與漂白後熒光恢復 (FRAP)： 介紹瞭使用核受體-熒光蛋白融閤體在活細胞內追蹤其核質穿梭的動力學過程。FRAP 實驗被詳細描述為量化核受體在染色質結閤與遊離池之間的交換速率的有效工具。 第四部分：體內模型中的功能驗證與成像 7. 轉基因與條件性敲除小鼠模型的建立與分析 將體外發現轉化為整體生物學意義，需要可靠的動物模型。 Cre-LoxP 係統的精確控製： 詳細討論瞭如何利用特定組織或時間點特異性的 Cre 酶（如 Adipoq-Cre 或 Albumin-Cre）來建立條件性敲除（cKO）核受體的小鼠模型，以研究其在肝髒、脂肪組織或內分泌腺中的生理功能。 代謝錶型分析： 針對代謝性核受體（如 PPARs 或 LXRs），本指南提供瞭全麵的體內錶型分析方案，包括高脂飲食誘導的胰島素抵抗模型、脂肪酸氧化速率測定、以及肝髒脂肪變性的組織學和生化評估。 8. 核受體與組織微環境的相互作用 組織特異性蛋白質組學： 介紹瞭利用前沿的定量蛋白質組學技術，如 TMT 標記和高分辨率質譜，來比較野生型與核受體突變小鼠特定組織（如腎上腺或腦部）的蛋白錶達譜變化，從而發現新的下遊信號通路或調控靶點。 本指南提供瞭一套全麵且不斷更新的實驗工具箱，旨在賦能研究人員剋服核受體研究中的技術瓶頸，揭示這些核心調控因子在復雜生命現象中的精確機製。

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這本書的裝幀和排版風格繼承瞭該係列一貫的嚴謹和實用主義路綫，文字密度極高，幾乎沒有多餘的空洞描述，直奔主題。這對於我這種習慣瞭快速提取關鍵信息的研究人員來說，是一種效率的體現。尤其值得稱贊的是，書中對各種緩衝液配方和試劑濃度的標注異常精確，甚至細化到瞭特定批次試劑的適用性建議，這在很多通用教科書中是看不到的細節。我在嘗試復現其中一個關於視黃酸受體（RAR）轉錄激活活性的體外重建實驗時，嚴格按照書中的“Protocol 4.2”進行操作，結果得到瞭比以往任何一次都穩定和可重復的結果。這強烈的可重復性印證瞭其作為“方法學”專著的權威性。不過，這種極端的實用性也帶來瞭一個小小的副作用：圖錶的視覺化效果相對欠缺，很多關鍵的數據趨勢需要讀者花費額外精力去對比文本描述纔能完全理解，如果能在關鍵的機製圖示上采用更多彩色、高清的分子模型渲染，而不是傳統的黑白綫條示意圖，對於理解復雜的蛋白質-蛋白質相互作用網絡會更有幫助。

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這本書給我的整體感受是，它是一份極其紮實、信息密度極高的“工具箱”，而不是一本連貫的“讀物”。它的價值在於它所收錄的那些經驗性、細節化的技術參數和“民間智慧”，這些是大型綜述文獻無法提供的。比如，書中關於如何使用特定抗體處理細胞核提取物以防止核受體磷酸化失活的“小竅門”，對於日常實驗的成功率有著立竿見影的提升作用。不同作者撰寫的章節之間，風格差異較大，有的極其詳盡，如對質譜聯用技術在核受體相互作用組研究中的應用描述，幾乎可以作為一篇獨立的綜述來引用；而另一些章節則顯得有些倉促，對一些新興的成像技術（如STORM/PALM在核內受體成像中的應用）的介紹過於泛泛。總而言之，如果將這本書看作一本參考手冊，它無疑是頂級的，但如果期待它能像一本結構完整的科學專著那樣，提供一個從宏觀到微觀、邏輯嚴密的知識體係，那麼它在某些前沿章節的深度和廣度上，還有提升的空間，適閤已經有一定基礎，急需解決特定技術瓶頸的研究人員使用。

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這本書的封麵設計著實引人注目，那種深邃的藍色調配上精密的科學插圖，一下子就抓住瞭我的眼球。我當時正在尋找一些關於基因調控和信號通路的前沿研究方法，手頭上的資料大多陳舊或者過於理論化，缺乏實操指導。這本書的厚度和專業性讓我對它抱有極高的期望，尤其是它隸屬於“Methods in Enzymology”這個久負盛名的係列，這意味著內容必然是經過嚴格篩選和驗證的“乾貨”。我翻閱瞭目錄，發現其中關於核受體激動劑篩選和下遊信號分子鑒定的章節，那種詳盡的步驟描述，簡直就像是直接從實驗室的SOP（標準操作程序）中摘錄齣來的一樣。這對於我們這種需要快速建立和優化實驗流程的課題組來說，簡直是雪中送炭。我特彆留意瞭其中關於高通量篩選技術的部分，作者似乎並未停留在理論層麵，而是深入探討瞭如何剋服傳統酶聯免疫吸附試驗（ELISA）在定量分析核受體活性時的局限性，轉而推薦使用基於BRET/TERA等新型報告基因係統的實時監測方法。這種注重實用性、緊跟技術革新的態度，讓我對後續的學習充滿信心，相信它能迅速提升我實驗的準確性和效率。

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我購買這本書的初衷是希望能在錶觀遺傳學與核受體調控的交叉領域找到突破口，特彆是在組蛋白修飾酶與受體復閤物結閤模式的解析技術方麵。因此，我花瞭相當大的篇幅去研讀其中關於染色質免疫共沉澱測序（ChIP-seq）優化方案的部分。書中詳細對比瞭不同交聯試劑對核受體特異性結閤位點捕獲效率的影響，這確實提供瞭寶貴的優化思路。然而，我在尋找如何結閤Proximity Ligation Assay (PLA) 或 Hi-C技術來研究核受體在三維基因組結構中發揮作用的具體操作流程時，發現這部分內容相對簡略，更像是對現有技術的簡單羅列，而非深入的實操指導。我期待看到的是如何設計特異性的引物對，如何有效去除背景噪音，以及如何處理PLA産生的大量圖像數據以量化受體在核內特定“熱點”區域的聚集程度。目前的描述更像是前置知識的介紹，而不是前沿技術的深度應用指南，這讓我感到在最想攻剋的難題上，這本書的“方法論”深度略有不足。

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坦白說，我購買這本書時，內心是抱著一種近乎“朝聖”的心態去期待的，畢竟這是一個專門聚焦於“核受體”這一復雜調控傢族的深度挖掘。然而，初讀幾章後，我發現它在基礎理論的鋪陳上略顯保守，仿佛是為已經非常熟悉該領域背景的專傢準備的“高級參考手冊”，而非一本能夠帶領初學者入門的教材。例如，在闡述經典的配體結閤域（LBD）與DNA結閤域（DBD）的互作機製時，引用的文獻大多集中在十年前的經典發現上，對於近五年內湧現齣的全新轉錄因子協同作用模型探討得不夠深入。我更期望看到一些關於新型核受體亞型（比如一些孤兒受體）在代謝疾病中最新被發現的功能數據，以及如何利用CRISPR/Cas9等基因編輯工具來精確模擬體內環境，以更好地研究這些受體在生理和病理狀態下的動態變化。如果能在方法論之外，增加一到兩個具有突破性的案例研究，展示如何利用書中的技術成功解析一個未知的信號級聯反應，那這本書的價值無疑會更上一層樓。

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