Techniques in Quantification and Localization of Gene Expression pdf epub mobi txt 电子书下载 2026

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出版者:Birkhäuser Boston

作者:Patterson, Bruce K. 编

出品人:

页数:167

译者:

出版时间:2000-01-24

价格:USD 159.00

装帧:Hardcover

isbn号码:9780817640347

丛书系列:

图书标签:

Gene expression
Quantification
Localization
Molecular biology
Biotechnology
In situ hybridization
Microscopy
RNA analysis
Genomics
Proteomics

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具体描述

The molecular basis of disease is the driving force in biomedical research. Gene detection, quantification, and localization are required to determine disease pathogenesis. In as much as DNA is the genetic potential in a particular organism, RNA and protein expression are the functional result of our genetic program. "Techniques in Localization of Gene Expression" describes in great detail the methods used to quantify and localize gene expression. Sensitive detection of gene expression is hindered by poor recovery or preservation of target sequences. "Techniques" emphasizes optimized methods to ensure full recovery and preservation of targets from specimen acquisition through detection of specific targets and final analysis. Situ Analyses of cells and tissues are also discussed. One of the weaknesses in biomedical research has been the use of in vitro model systems consisting of cell lines that may or may not mimic the in vivo conditions. These model systems are necessary to ask several questions on cells and tissues with controlled variables in the absence of strategies to ask many questions at the same time. Multiparameter analysis can circumvent the necessity of in vitro model systems by allowing many questions to be answered on a cell or tissue at a single point in time. Using fluorescent dyes, on can answer many questions about a particular cell or tissue. One color, one question is an overriding theme of this book. The limitations of this approach are the number of colors in the spectrum and our ability to resolve them. Readers will find working protocols that have been developed and used routinely in the author's laboratory. Representative applications will be described using the various gene quantification and localization protocols to illustrate the utility of the techniques.

基因表达的定量与定位技术：方法学综述与应用前沿图书内容概述：本书旨在为生命科学研究者提供一个全面而深入的视角，聚焦于当前分子生物学和生物技术领域中，用于检测、定量和空间解析基因表达水平的关键技术。本书并非简单罗列实验步骤，而是深入剖析每种技术背后的生物学原理、数学模型、实验设计考量、数据分析流程以及它们在不同研究范式中的应用局限与潜力。全书内容围绕“如何精确回答‘什么基因在何时何地以多少量级表达’这一核心问题”展开，涵盖了从经典到前沿的多种技术平台。第一部分：基础原理与核酸检测的基石本部分奠定了理解后续高级技术的基础，重点阐述了核酸分子（mRNA、ncRNA）的性质、如何从复杂生物样本中高效、无偏好地提取和纯化，以及这些分子如何作为基因表达的指示物。第一章：从组织到分子——样本制备与质量控制详细讨论了组织匀浆、细胞分离（流式细胞术、密度梯度离心）、RNA/DNA的稳定化（如迅速冷冻、RNA保存液）和提取纯化。特别强调了影响后续定量结果的偏倚来源，如RNase污染控制、细胞异质性对平均表达量的影响，以及如何利用定量PCR标准曲线和电泳分析评估核酸的完整性和纯度。第二章：互补性与杂交原理的复兴回顾了原位杂交（ISH）技术的发展，从放射性标记到酶促显色系统。重点分析了非编码RNA（如lncRNA, miRNA）的原位检测挑战，以及如何通过荧光原位杂交（FISH）技术，特别是基于多重标记的体系（如RNAscope），实现对单个细胞内多个转录本的共定位分析。本章深入探讨了探针设计策略、信号放大机制和背景噪音的抑制。第二部分：宏观量化：基于高通量测序的方法学解析这部分集中探讨了当前主流的、能够对全基因组或全转录组水平进行大规模量化的技术，特别是高通量测序（NGS）相关的策略。第三章：转录组测序（RNA-Seq）的深度剖析本书详细区分了基于PolyA捕获（针对mRNA）和基于Total RNA捕获（涵盖ncRNA）的文库构建策略的差异。对于测序深度、饱和度、偏倚矫正（如GC偏倚、长度偏倚）进行了严格的数学建模讨论。关键内容包括： 1. 定量指标的转换：从原始序列读数到RPKM、FPKM、TPM的演变，并阐述在不同比较实验中选用何种标准化指标更为合理。 2. 差异表达分析（DEA）：深入讲解了基于负二项分布（如DESeq2, edgeR）的统计模型如何处理测序数据的固有方差，以及如何进行多重检验校正（FDR）。第四章：单细胞转录组测序（scRNA-Seq）的革命性进展本书将scRNA-Seq视为基因表达“定位”到细胞层面的关键技术。内容涵盖了主要的实验平台（如3’端定址技术如10x Genomics、Smart-Seq2的全长测序），并侧重于解决单细胞数据特有的挑战： 1. 稀疏性（Dropout）处理：比较了基于插补（Imputation）和基于概率模型的方法。 2. 降维与聚类：详细解析了主成分分析（PCA）、t-SNE、UMAP等算法在细胞群识别中的应用，并讨论了批次效应（Batch Effect）的矫正技术。 3. 细胞轨迹推断：阐述了如何利用伪时间（Pseudotime）分析重建细胞发育或分化过程中的动态表达变化。第三部分：空间定位：从细胞到组织分辨率的成像技术本部分专注于如何在组织或活体环境中，将基因表达信号与其精确的生物学位置进行关联。第五章：空间转录组学的前沿技术这是本书的重点之一，系统介绍了将测序能力与空间信息相结合的创新方法： 1. 基于芯片的捕获技术（如Visium）：讲解了如何设计带有空间条形码的寡核苷酸探针，实现对组织切片上数千个六边形区域的整体转录组捕获。讨论了数据处理中如何将测序数据重新映射回组织图像。 2. 基于原位测序的技术（如MERFISH, seqFISH+）：深入探讨了通过迭代的荧光信号解码和成像，实现对数万个基因在单细胞分辨率上进行空间定位的复杂流程。重点分析了图像采集、解码算法的精度和通量限制。第六章：高分辨率的分子成像技术涵盖了更侧重于蛋白质或特定RNA分子定位的经典与新兴技术： 1. 改进的荧光原位杂交（FISH）在组织中的应用：讨论了如何通过三维扩展（Expansion Microscopy, ExM）结合FISH，在保持分子精度的同时提高信号的可分辨性。 2. 蛋白质与核酸的共定位分析（Proximity Ligation Assays, PLA）：解释了PLA如何用于检测细胞核内染色质结构、RNA聚合酶与特定基因座的物理接近性，从而间接反映转录活性状态。第四部分：功能验证与定量校准为确保高通量数据的可靠性，本部分强调了传统但不可或缺的功能验证技术，以及如何利用这些技术对NGS数据进行校准。第七章：基于PCR和微流控的精确定量虽然是经典技术，但其在验证和绝对定量中的地位无可替代。详细介绍了： 1. 实时荧光定量PCR（qPCR）：强调了内参基因的选择标准、溶解曲线分析、以及如何使用标准品进行绝对定量。 2. 数字PCR（dPCR）：阐述了微流控油包水乳液或微孔板阵列如何将稀释的样本分区，实现对单个分子级别的计数，消除Cq值的依赖性，适用于稀有转录本的精准测量。第八章：表达调控的动态监测讨论了如何实时监测基因表达过程，而不仅仅是静态快照： 1. 报告基因系统（Reporter Assays）：深入解析了基于荧光素酶、GFP/RFP报告基因（如启动子驱动报告）在瞬时转染和稳定转染细胞系中的应用，以及如何通过光密度或荧光强度进行定量。 2. 基于速度的分析：探讨了如何通过标记细胞内新合成的RNA（如使用Actinomycin D或Click化学标记），结合FISH或Sequencing，来估算基因的转录速率。总结：整合性研究范式的构建本书最后部分将所有技术融会贯通，指导读者如何根据具体研究问题（如疾病诊断、药物靶点发现、发育路径解析）选择最合适的技术组合（例如，先用RNA-Seq筛选候选基因，再用空间转录组定位细胞类型，最后用dPCR验证特定亚群的表达量）。强调了数据整合、跨平台验证的重要性，以及未来自动化、高通量、低成本检测的发展方向。全书配有大量图表、流程图和对比矩阵，旨在为专业人士提供一本既有理论深度又有实践指导价值的参考手册。