目 錄
緒論
本教程基因工程實驗流程圖
實驗一 堿法抽提質粒DNA
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）剋隆載體pUC118質粒與宿主菌MV1184
1pUC118質粒結構
2MV1184宿主菌F＇因子基因型
3MV1184宿主菌染色體基因型
（二）質粒DNA的抽提
1裂解細胞
2分離
3純化
（三）堿法抽提的主要試劑
（四）抽提産量與試劑用量的估算
1抽提産量估算
2試劑用量估算
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗二 電泳法測定DNA的濃度與純度
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）瓊脂糖凝膠
（二）電泳時DNA遷移的影響因素
1DNA分子質量的影響
2DNA構型的影響
3膠濃度的影響
4電場強度的影響
5溴乙錠的影響
6電泳緩衝液的影響
7堿基組成與電泳溫度的影響
（三）電泳緩衝液
1TAE
2TBE
3TPE
（四）上樣液
（五）上樣量的控製
（六）DNA電泳條帶的檢測
（七）電泳的分子質量梯度標誌
1綫狀分子質量梯度標誌
2超螺鏇分子質量梯度標誌
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗三 載體與供體DNA的酶切
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）限製性內切酶的一般性質
1一般限製酶的識彆位點
2識彆超長堿基序列的酶
3各類粘性末端的特點
4同識彆序列的酶
5酶切反應中的位點優先現象
6DNA構型對酶切的影響
7近末端切割
8酶的星號反應
9大腸杆菌中甲基化現象對酶切的影響
10能切割單鏈的限製酶
（二）限製性內切酶的使用
1製作基因圖譜
2剋隆基因
3製備探針
（三）酶切方式
1部分酶切
2完全酶切
（四）酶的質量鑒定
（五）酶的保存
（六）酶單位的定義
（七）限製酶的作用條件
1作用溫度
2緩衝體係
3反應時間
4DNA的純度與濃度
（八）終止酶反應的方法
（九）酶切失敗的原因及處理的方法
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗四 目的基因片段的迴收
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）各類迴收方法
1電泳迴收法
2收集孔電泳迴收法
3機械破碎凝膠迴收法
4溶（熔）膠迴收法
5瓊脂糖酶降解凝膠迴收法
（二）迴收方法的選擇與操作注意事項
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗五 載體與供體DNA的連接
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）早期的連接理論
（二）近期的計算機模擬反應進程
（三）連接酶
（四）連接反應的影響因素
1連接緩衝液的影響
2pH值的影響
3ATP濃度的影響
4連接溫度與時間的影響
5酶濃度的影響
6DNA濃度的影響
7DNA序列的影響
8其他抑製因素的影響
（五）三種連接酶單位定義
1Weiss單位
2d（A―T）環化單位
3粘性末端單位
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗六 CaCl2法轉化大腸杆菌
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）各種轉化方法與轉化率的衡量指標
（二）轉化率的影響因素
1試劑（包括水）純度與器皿清潔程度的影響
2接種前菌種保存方式的影響
3宿主菌生長時期的影響
4CaCl2法0℃放置時間的影響
5化閤物與無機離子的影響
6質粒大小、構型與復製起點的影響
7競爭DNA的影響
8共轉化質粒的影響
9質粒DNA與轉化細胞比例的影響
10菌株基因型recA＋與recA 的影響
11連接緩衝液的影響
（三）大腸杆菌中的限製係統與限製修飾係統
1Mcr限製係統
2Mrr限製係統
3hsd限製修飾係統
（四）宿主菌的選擇
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗七 酚/氯仿法快速鑒定轉化子
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）DNA水平檢測
1快速抽提電泳分析
2快速抽提酶切分析
3原位雜交法
4斑點雜交法
5Southern雜交法
6DNA序列分析
（二）mRNA水平檢測
1R環電子顯微鏡法檢測
2雜交抑製翻譯
3雜交選擇翻譯
（三）蛋白質水平檢測
1沉澱免疫檢測法
2其他免疫檢測法
（四）功能水平檢測
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗八 隨機引物法標記DNA探針
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）酶法標記於鏈上
1缺口轉移法
2隨機引物法
3PCR法
（二）酶法標記於末端
13′末端標記法
25＇末端標記法
（三）化學法標記於鏈上
1直接標記法
2介導標記法
（四）化學法標記於末端
1閤成時引入氨基或巰基
2閤成後引入氨基或巰基
（五）光化學法標記於鏈上
1芳香疊氮化閤物
2呋喃香豆素衍生物
（六）人工閤成於鏈上
1摻入堿基類似物
2摻入核糖類似物
（七）檢測酶直接標記法
1檢測酶直接標記於鏈上
2檢測酶直接標記於末端
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗九 菌落原位吸印
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）各類吸印膜
1硝酸縴維素膜（NC膜）
2疊氮氧苄甲基縴維素紙（DBM紙），重氮苯硫醚
縴維素紙（DPT紙）和氨基苯硫醚縴維素紙（APT
紙）
3二乙氨基乙基縴維素紙（DEAE紙）
4ECTELA紙
5尼龍膜
6聚偏二氟乙烯膜（PVDF膜）
7其他膜
（二）各種轉移方法
1毛細管轉移法
2真空轉移法
3電轉移法
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗十 DNA分子雜交
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）DNA的復性與雜交反應動力學方程式
1雙鏈DNA的復性過程
2單鏈探針的雜交過程
3雙鏈探針的雜交過程
（二）雜交速率的影響因素
1探針分子復雜性的影響
2探針分子濃度的影響
3雜交溫度的影響
4雜交液pH值的影響
5雜交液中離子強度的影響
6雜交液中甲酰胺濃度的影響
7雜交促進劑的影響
（三）雜交反應的兩種模式
（四）雜交分子穩定性的影響
1雜交液中Na＋離子濃度的影響
2探針分子中GC％的影響
3雜交液中甲酰胺濃度的影響
4探針分子長度的影響
5與目標DNA錯配的影響
6雜交液pH值的影響
（五）雜交的步驟
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗十一 顯色法檢測雜交結果
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）酶法顯色原理
1辣根過氧化物酶
2堿性磷酸酯酶
（二）免疫法檢測原理
（三）生物素－親和素法檢測原理
（四）其他檢測法
1膠體金標記――銀加強檢測法
2時間分辨熒光檢測法
三 試劑與器材
四 實驗步驟
實驗十二 PCR法鑒定人的性彆
一 實驗目的
二 實驗原理
（一）PCR的引物設計
1引物的長度
2引物的GC％含量
3引物的3′端起始堿基
4引物無迴文對稱結構
5引物自身不能配對
6兩個引物的Tm值
7兩個引物之間不能配對
（二）PCR的反應體係
1模闆DNA
2引物
三 分光光度計的使用
四 電泳儀的使用
五 微量移液器的使用
六 凝膠攝影
七 酚的重蒸與飽和處理
八 RNA酶的使用與預處理
九 緩衝液作用原理與Tris・Cl的配製
十 菌種與DNA樣品的保存
十一 器皿的清洗處理
十二 器皿和試劑的滅菌處理
十三 器皿的矽化處理
十四 大腸杆菌常用基因型
參考文獻
· · · · · · (收起)